中国农科院哈兽研学者在伪狂犬病毒基因编辑方面取得重要进展

时间:2018-03-07 16:00:29 作者:中国病毒学论坛 阅读: 8412 点赞: 61 分享: 44

2018年3月6日,国际知名期刊美国实验生物学学会联合会杂志《FASEB Journal》在线发表中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物病原监测与流行病学团队关于伪狂犬基因编辑的重要文章。本研究对疱疹病毒的基因改造具有重要的指导意义。相关论文“CRISPR/Cas9-mediated 2-sgRNA cleavage facilitatespseudorabies virusediting”链接如下:http://www.fasebj.org/doi/10.1096/fj.201701129R

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV) 又称奥耶斯基病(Aujeszky) 病毒或猪I型疱疹病毒,与人单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)以及带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)同属α疱疹病毒。PRV可引起多种家畜和野生动物感染,猪是该病毒的原发感染宿主和传染源,PRV自发现以来,在全球范围广泛流行,被国际动物卫生组织(WorldOrganisation for Animal Health,OIE)列为B类传染病,其危害极其严重。近日,复旦大学附属华山医院通报一起人感染PRV的个案,表明PRV对人类健康具有潜在的威胁!

PRV的防控在于有效的疫苗,然而,PRV因其基因组较大,在基因水平对其改造一直存在技术瓶颈。汤艳东博士通过对CRISPR/Cas9技术创新性应用,系统的阐明了PRV基因编辑的策略以及影响基因编辑的关键因素。研究表明,应用双sgRNA能够更为高效的进行PRV的基因敲除与插入。同时,研究者进行了病毒感染与转染基因组两种策略进行PRV基因编辑效率的评估,结果发现,转染基因组的方法产生重组病毒的效率明显高于感染组处理。更为重要的是,经过系统比较,重组效率高主要是由于应用CRISPR技术能够显著减少背景毒株的量,而不是传统认为的增加重组克隆。本研究也证实了基因插入效率也取决于背景毒株的复制效率。动物病原监测与流行病学团队首席科学家蔡雪辉研究员指出,根据本文建立的高效基因编辑平台,可以在2周之内研发出针对新发PRV变异毒株的疫苗,这对PRV的及时防控具有重要意义。

本研究是在国家重点研发计划(2016YFD0500100 新发与再现畜禽重大疫病的致病与免疫机制)的资助下进行的。汤艳东博士,郭金潮硕士,王同云硕士为本文共同第一作者。蔡雪辉研究员,安同庆研究员为共同通讯作者。(王同云)

Abstract

Several groups have used CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) for DNA virus editing. In most cases, one single-guide RNA (sgRNA) is used, which produces inconsistencies in gene editing. In this study, we used a swine herpesvirus, pseudorabies virus, as a model to systematically explore the application of CRISPR/Cas9 in DNA virus editing. In our current report, we demonstrated that cotransfection of 2 sgRNAs and a viral genome resulted in significantly better knockout efficiency than the transfection–infection-based approach. This method could result in 100% knockout of ≤3500 bp of viral nonessential large fragments. Furthermore, knockin efficiency was significantly improved by using 2 sgRNAs and was also correlated with the number of background viruses. We also demonstrated that the background viruses were all 2-sgRNA–mediated knockout mutants. Finally, this study demonstrated that the efficacy of gene knockin is determined by the replicative kinetics of background viruses. We propose that CRISPR/Cas9 coupled with 2 sgRNAs creates a powerful tool for DNA virus editing and offers great potential for future applications.

本期编辑:Tony

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